منو

    مقالات

    بافر (MgCl2) برای واکنش PCR

    بافر (MgCl2) برای واکنش PCR

    اصول اولیه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

     

    واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به منظور تقلید از روش خود طبیعت برای تکثیر DNA ایجاد شد. DNA  یک توالی تکرار شونده از نوکلئوتیدها است و هر نوکلئوتید شامل سه قسمت است. ستون فقرات DNA یک واحد قند و فسفات تکرار شونده است و هر قند یک پایه نیتروژنی متصل است. در طول هر رشته چهار بازآلی نیتروژن دار وجود دارد، گوانین، سیتوزین، آدنین و تیمین. 
    DNA  شامل دو رشته قند فسفات است که به موازات یکدیگر قرار دارند و دو پایه نیتروژنی بین هر دو قند به هم می پیوندند. هنگامی که DNA در بدن تکثیر می شود، آنزیمی به نام هلیکاز پیوندهای بین بازهای نیتروژنی را از هم می شکند. آنزیم دوم، DNA پلیمراز، نوکلئوتیدهای جدیدی را به جای نوکلئوتیدهای قدیمی متصل می کند. در نهایت، آنزیم سوم به نام DNA لیگاز به مولکول های جدید دوباره به هم می پیوندد.

     


    اجزای واکنش PCR

     

     

    برای تکثیر DNA در یک واکنش آزمایشگاهی باید چند تغییر ایجاد شود. به جای هلیکاز، واکنش PCR  به سادگی از گرما برای شکستن پیوندهای بین بازهای نیتروژنی استفاده می کند. 
    DNA  پلیمراز انسانی برای تحمل این دماها به اندازه کافی پایدار نیست. به جای آن از یک مولکول مشابه به نام Taq polymerase یا پلیمراز مقاوم در برابر حرارت استفاده می شود، زیرا می تواند حرارت مورد نیاز PCR را تحمل کند. علاوه بر این، واکنش PCR به نوکلئوتیدهای آزاد، بافر و منیزیم نیاز دارد.

     


    مزایای PCR

     

     

    این فناوری پیشگامانه دانشمندان را قادر ساخت تا تنها در چند ساعت یک رشته DNA را صدها میلیارد بار ضرب کنند. تنها چیزی که برای این آزمایش نیاز بود فقط لوله های آزمایش، چند ماده شیمیایی و حرارت بود. بدون PCR، تجزیه و تحلیل مولکولی و ژنتیکی ژنوم یک موجود زنده یک رویداد غیرممکن بود.
    این ابزار آزمایشگاهی در طیف وسیعی از آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی، از جمله زیست‌شناسی مولکولی، زیست‌شناسی گیاهی، جانورشناسی و بیوتکنولوژی ضروری است تا بخش کوچکی از DNA را تقویت کند. محصولات PCR حاصل در سایر فرآیندهای آزمایشگاهی مانند انگشت نگاری DNA یا تجزیه و تحلیل ژنتیکی استفاده می شود 
    PCR  اغلب "فنوتایپ مولکولی" نامیده می شود و امروزه چندین روش PCR برای اهداف مختلف در دسترس هستند، از جمله RT-PCR، Real-Time PCR، Multiplex PCR و Hot-Start PCR.

     


    مراحل PCR

     

     

    صرف نظر از انواع مختلف PCR، همه آنها شامل سه مرحله اساسی هستند:
    مرحله دناتوره شدن: این مرحله به دناتوراسیون اسید نوکلئیک نیز معروف است. در اینجا، حرارت دادن الگوی DNA در دمای 95 درجه سانتیگراد، با شکستن پیوندهای هیدروژنی، مارپیچ آن را به دو رشته منفرد تبدیل می‌کند.
    مرحله بازپخت: در دمای 50 تا 65 درجه سانتیگراد (به نام دمای آنیلینگ)، پرایمرها به DNA الگوی تک رشته ای متصل می شوند.
    مرحله طویل شدن: در این مرحله سنتز یک رشته DNA جدید آغاز می شود. دما بین 72-74 درجه سانتیگراد تنظیم می شود که در آن Taq DNA پلیمراز که بیشتر DNA پلیمراز در واکنش های PCR استفاده می شود) به پرایمرها متصل می شود و از dNTPs (دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات) برای تشکیل DNA جدید استفاده می کند.

     

    معرف های مورد نیاز برای PCR

     

    معرف های مورد نیاز برای اجرای یک سنجش PCR شامل یک الگوی DNA است. این می تواند DNA  ژنومی، پلاسمید یا cDNA باشد، آنزیم های DNA پلیمراز، پرایمرهاdNTPs ، dATP، dGTP، dCTP، dTTP، و بافرهای PCR، که شامل tris- HCL، KCL و MgCl2 است.
    همه این اجزای مخلوط واکنش به روش‌های مختلف بر واکنش PCR تأثیر می‌گذارند، زیرا همه آن‌ها با هماهنگی کار می‌کنند تا میلیون‌ها آمپلیکون برای ژن مورد نظر تولید کنند.

     


    نقش MgCl2 در واکنش های PCR چیست؟

     

     

    MgCl2 (کلرید منیزیم) یک عنصر ضروری ترکیب اصلی PCR است. به عنوان یک کوفاکتور، فعالیت آنزیمی DNA پلیمراز را افزایش می دهد و در نتیجه تکثیر DNA را تقویت می کند.
    کوفاکتورها یون ها یا مولکول های غیر پروتئینی هستند که به آنزیم ها کمک می کنند تا وظایف خود را انجام دهند. بنابراین، فقدان این کوفاکتورها باعث مرگ آنزیم‌ها می‌شود و اصلاً هیچ عملکردی ندارند. این کوفاکتورها می‌توانند یون‌های فلزی با بار مثبت (مانند یون‌های روی، آهن یا منیزیم) یا (مولکول‌های کوچک مبتنی بر کربن )به عنوان مثال، ویتامین B12 باشند.
    بنابراین یون منیزیم (+Mg2) به عنوان یک کوفاکتور برای فعالیت DNA پلیمرازها با امکان ادغام dNTPs در طول پلیمریزاسیون عمل می کند. یون های منیزیم در محل فعال آنزیم، تشکیل پیوند فسفودی استر را بین 3'-OH یک آغازگر و گروه فسفات یک dNTP کاتالیز می کنند.

    برای درک بهتر نقش کوفاکتورها به این مثال ها نگاه کنید:

    آنزیم پیروات دهیدروژناز، که در گلیکولیز و چرخه اسید سیتریک دخیل است، نمی تواند بدون کوفاکتورهای خود که شامل TPP، FAD، NAD+، CoA و +Mg2 هستند، کار کند.
    کربنیک انیدراز، آنزیمی که در حفظ pH بدن ما نقش دارد، در غیاب کوفاکتور خود، (یون روی) نمی تواند عمل کند.
    به غیر از افزایش فعالیت DNA پلیمراز، MgCl2 همچنین اتصال پرایمر را در مکان های خاص در طی واکنش PCR تسهیل می کند.

     


    مکانیسم عملکردMgCl2 

     

     

    MgCl2 هم در تسهیل فعالیت Taq DNA پلیمراز و هم ویژگی بازپخت پرایمر روی رشته DNA/RNA الگو دارد.
    مکانیسم مولکولی MgCl2 در افزایش فعالیت Taq DNA پلیمرازها. یون+Mg2 (یا یون منیزیم) کلرید منیزیم در فرآیند تقویت PCR برای ارتقاء فعالیت کاتالیزوری آنزیم Taq DNA پلیمراز استفاده می شود.
    در طی تقویت PCR، یون +Mg2 به یک dNTP در گروه آلفا فسفات خود متصل می شود و حذف بتا و گاما فسفات ها را تسهیل می کند. dNMP حاصل از طریق گروه فسفات خود، با 3’ OH (هیدروکسیل) نوکلئوتید مجاور، یک پیوند فسفودی استر تشکیل می دهد.

     


    نقش MgCl2 در تسهیل اتصال پرایمر

     

     

    Mgcl2 با تأثیر بر دمای ذوب پرایمر (Tm) به اتصال پرایمرها در مکان های خاص کمک می کند.
    Tm به عنوان دمایی تعریف می شود که در آن نیمی از DNA دوبلکس به یک رشته منفرد جدا می شود که نشان دهنده پایداری دوبلکس است.
    MgCl2 Tm واکنش PCR را برای برهمکنش بهتر بین پرایمر و DNA الگو افزایش می دهد. یون منیزیم MgCl2 به یون فسفات با بار منفی DNA متصل می شود و دافعه الکترواستاتیک بین دو رشته DNA را کاهش می دهد. این منجر به بازپخت مناسب پرایمرها با رشته های DNA مکمل آنها می شود.

     


    اثرات افزایش و کاهش 2MgCl  طی واکنش PCR

     

     

    کلرید منیزیم روش ترجیحی برای افزودن منیزیم به آزمایش PCR است. پلیمراز مقاوم در برابر حرارت به حضور منیزیم نیاز دارد تا به عنوان یک کوفاکتور در طول فرآیند واکنش عمل کند. نقش آن مشابه نقش یک کاتالیزور است. منیزیم عملاً در واکنش مصرف نمی شود، اما واکنش بدون حضور منیزیم نمی تواند ادامه یابد.

     

    افزایشMgCl2: 


    مقادیر بیش از حد کلرید منیزیم در واکنش های PCR منجر به اتصال غیر اختصاصی پرایمرها می شود و در نتیجه همانندسازی DNA خطا می کند. بنابراین، الکتروفورز ژل آگارز نوارهای DNA بیشتری را نشان می دهد. 
    بنابراین هر چه منیزیم بیشتری به واکنش PCR اضافه شود، واکنش سریعتر انجام می شود. با این حال، این لزوما چیز خوبی نیست. اگر منیزیم بیش از حد وجود داشته باشد، DNA پلیمراز خیلی سریع کار می کند و اغلب در فرآیند کپی خطا ایجاد می کند. این کار منجر به تولید رشته های مختلف DNA می شود که لزوماً نمونه اولیه ارائه شده را نشان نمی دهند.

     

    کاهش MgCl2: 


    در این شرایط، پرایمرها نمی توانند با الگوی DNA جفت شوند، که منجر به تقویت ضعیف یا شکست کامل PCR می شود. 
    اگر منیزیم در یک واکنش به مقدار محدودی عرضه شود، واکنش آنطور که باید به سرعت پیش نمی رود. بنابراین اگر طی واکنش منیزیم کافی وجود نداشته باشد، مقداری از DNA پلیمراز فعال نمی شود و کار نمی کند. با این حال، گرما DNA موجود را از هم جدا کرده و دوباره به هم متصل نخواهد شد. بنابراین، اگر منیزیم کافی وجود نداشته باشد، کل آزمایش خراب می شود.

     

     

    خرید اینترنتی (MgCl2) برای واکنش PCR

     

     

    یون‌های منیزیم که به شکل کلرید منیزیم  (MgCl2) به واکنش اضافه می‌شوند، آن ها یک کوفاکتور ضروری برای فعالیت آنزیم پلیمراز در طی PCR هستند. غلظت خیلی کم باعث تقویت ضعیف یا شکست کامل PCR می شود، در حالی که مقدار زیاد آن می تواند باعث تقویت غیر اختصاصی شود.
    مخلوط های اصلی PCR حاوی MgCl2 کافی برای استفاده معمولی هستند. اگر شما دانشجو و یا محقق هستید و قصد خرید این بافر را دارید ما به شما بافر10x Taq Buffer (MgCl2) مبنا مد را معرفی می کنیم. برای خرید این محصول فقط کافیست وارد 10x Taq Buffer (MgCl2) شوید و محصول مورد نظر خود را سفارش دهید.
    10x Taq Buffer (MgCl2) فروشگاه مبنا مد  در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می شود.نگهداری موقت در دمای اتاق هیچ اثر مخربی بر کیفیت این معرف ندارد. به صورت اختیاری در لوله های استریل بریزید و منجمد کنید تا آلودگی میکروبی بالقوه پس از باز کردن به حداقل برسد.

    اشتراک گذاری

    24 ساعته

    پرداخت ایمن

    7 روز ضمانت برگشت

    تحویل اکسپرس